Zdolność do zidentyfikowania roli konkretnego genu w systemie zależy od kontroli ekspresji tego genu. W tym protokole opisujemy metodę stabilnej, warunkowej ekspresji receptorów Nod-Like (NLR) w komórkach THP-1 przy użyciu lentiwirusowego systemu ekspresji. System ten łączy wszystkie niezbędne składniki do indukowanej tetracykliną ekspresji genów w pojedynczym lentiwektorze z konstytutywną koekspresją markera selekcyjnego, co jest skutecznym środkiem do kontrolowania ekspresji genów przy użyciu pojedynczej infekcji wirusowej komórek . Odbywa się to na lentiwirusowej platformie ekspresyjnej trzeciej generacji, która poprawia bezpieczeństwo lentiwirusów i pozwala na większą ekspresję genów niż wcześniejsze platformy lentiwirusowe.
Plazmid ekspresyjny lentiwirusa jest najpierw modyfikowany tak, aby zawierał gen będący przedmiotem zainteresowania kierowany przez promotor TRE (element odpowiedzi tetracyklinowej) w prostym etapie klonowania bramy, a następnie jest kotransfekowany do komórek HEK293T wraz z plazmidami pakującymi i otoczkowymi w celu wytworzenia wirusa. Wirus jest używany do infekowania interesującego typu komórki przy niskim MOI, tak że większość transdukowanych komórek zawiera pojedynczą integrację wirusa. Zakażone komórki hoduje się z selekcją, a integracja wirusa jest weryfikowana przez qPCR.
Ekspresja genów w stabilnie stransdukowanych komórkach jest indukowana doksycykliną i walidowana przez qPCR, immunoblot i cytometrię przepływową. Ta elastyczna lentiwirusowa platforma ekspresyjna może być wykorzystywana do stabilnej i silnej indukcji interesującego genu w szeregu komórek do wielu zastosowań. Streszczenie graficzne: Schematyczny przegląd transdukcji lentiwirusowej komórek THP-1.
Profil ekspresji genów w komórkach jądrowych krwi obwodowej lentiwirusa małych przeżuwaczy — seropozytywnych i seronegatywnych kóz mlecznych w ich pierwszej laktacji
Odpowiedź immunologiczna na antygen wirusowy powoduje naciek komórek zapalnych do tkanki, co stwarza odpowiednie środowisko do replikacji wirusa w makrofagach i rekrutacji większej liczby monocytów do miejsca infekcji lub utajonych monocytów. Celem pracy była analiza profilu transkryptomicznego komórek jądrowych krwi obwodowej izolowanych od kóz seropozytywnych i seropozytywnych wobec SRLV w szczytowym okresie ich pierwszej laktacji. Seropozytywne kozy SRLV zostały prawdopodobnie zakażone siarą. Zaprojektowano i opracowano niestandardowe mikromacierze transkryptomiczne dla kóz , a mianowicie macierz ekspresji genów Capra hircus , która zawiera około 50 000 unikalnych transkryptów na mikromacierz .
Tylko cztery geny ulegały zróżnicowanej ekspresji, z podwyższoną ekspresją genów GIMAP2, SSC5D i SETX oraz obniżoną ekspresją genu GPR37 u kóz seropozytywnych wobec SRLV seronegatywnych. Jednak w analizie RT-qPCR wynik dla genu SETX nie został potwierdzony. Różnice w ekspresji badanych genów wskazują na aktywny proces zapalny u kóz seropozytywnych SRLV we wczesnym stadium infekcji.

Konstrukcja swoistego Smo lentiwirusa i ekspresja zakażonych komórek raka trzustki pozytywnych dla przeciwciała powierzchniowego CD24CD44
Celem tego badania było skonstruowanie wektora lentiwirusa niosącego gen Smo i transfekowanie komórek raka trzustki, w których stwierdzono obecność przeciwciała powierzchniowego CD24CD44 oraz wykrycie zakaźności. Zaprojektowano i zsyntetyzowano lentiwirusa niosącego określony fragment Smo oraz przetestowano jego funkcjonalność. Do dalszych badań eksperymentalnych i porównań wykorzystano grupę nadekspresji, grupę hamującą i grupę kontrolną ujemną. Pomyślnie zaprojektowano i wyprodukowano wirusa. Najlepszym obciążeniem wirusowym był wirus 1X106 TU, w którym wzrost komórek i efekt fluorescencji w studzienkach hodowlanych z rozcieńczeniem polibrenem były najlepsze. Są to warunki transfekcji i parametry transfekcji dla kolejnych eksperymentów. Plazmid ten wykryto przeciwciałem flagowym metodą Western blot.W rezultacie miał duży specyficzny prążek 250kD, a białko błonowe było z powodzeniem nadeksprymowane.
- Wyniki ekspresji Smo w pięciu grupach komórek po transfekcji wirusa wykryte za pomocą RT-PCR: grupa ślepa wyniosła 1,0038±0,0344, grupa ujemna CON238: 1,0276±0,2944d, grupa ujemna CON077: 0,8793±0,0402; Grupa nadekspresji LV-SMO15570-2: 2,7479±0,30808 i grupa inhibicji LV-SMO-RNAi37304-1: 0,2386±0,0481.
- Istniały różnice między grupą z nadekspresją i grupą z inhibicją a pozostałymi trzema grupami. Jednorodność wariancji: Bartlett F = 4,3530, P = 0,0016 < 0,05, heterogeniczny . Test KW: cc2 = 10,9905* P = 0,0267 i wystąpiła różnica istotna statystycznie.
- Zaprojektowany wirus osiągnął założone wymagania. Zaprojektowano fragment sRNA dla kluczowego genu Smo szlaku sygnałowego Hh i pomyślnie skonstruowano wektor lentiwirusa niosącego ten fragment.
- Ekspresję Smo analizowano po transfekcji komórek SW1990CD24CD44-dodatnich, co sugeruje, że funkcja fragmentu RNA zaprojektowanego dla kluczowego genu Smo w tym eksperymencie była skuteczna.
Promowanie właściwości immunomodulujących i różnicowania osteogennego mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej in vitro przez ekspresję gąbki miR-146a za pośrednictwem lentiwirusa
Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wywierają korzystny wpływ na naprawę tkanki kostnej zarówno poprzez funkcje immunomodulacyjne, jak i różnicowanie osteogenne. Jako jeden z pierwszych zidentyfikowanych miRNA, które regulują wrodzoną odpowiedź immunologiczną, doniesiono, że miR-146a służy jako regulator negatywnego sprzężenia zwrotnego w kilku przewlekłych chorobach zapalnych. Jednak większość badań koncentruje się na zrozumieniu, w jaki sposób miRNA-146a reguluje komórki odpornościowe i związane z nimi zaburzenia immunologiczne.
h CD47 Expression Lentivirus |
|||
LVP918 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h CD4 Expression Lentivirus |
|||
LVP1152 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h CD8a Expression Lentivirus |
|||
LVP1151 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h CD3E Expression Lentivirus |
|||
LVP1163 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h ADA Expression Lentivirus |
|||
LVP923 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h IL6 Expression Lentivirus |
|||
LVP1144 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h IL4 Expression Lentivirus |
|||
LVP1161 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h IL7 Expression Lentivirus |
|||
LVP1162 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h KDR Expression Lentivirus |
|||
LVP1176 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h FAS Expression Lentivirus |
|||
LVP1181 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h CDR1 Expression Lentivirus |
|||
LVP917 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h ESR1 Expression Lentivirus |
|||
LVP924 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h NME4 Expression Lentivirus |
|||
LVP932 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h EGFR Expression Lentivirus |
|||
LVP1142 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h NRP1 Expression Lentivirus |
|||
LVP1145 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h MUC1 Expression Lentivirus |
|||
LVP1148 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h PIGF Expression Lentivirus |
|||
LVP1154 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h BRAF Expression Lentivirus |
|||
LVP1156 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h ROS1 Expression Lentivirus |
|||
LVP1158 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h KLK3 Expression Lentivirus |
|||
LVP1171 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h NEK6 Expression Lentivirus |
|||
LVP1182 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h NEK7 Expression Lentivirus |
|||
LVP1183 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h GPNMB Expression Lentivirus |
|||
LVP921 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h DECR1 Expression Lentivirus |
|||
LVP927 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h DECR2 Expression Lentivirus |
|||
LVP928 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h NMRK1 Expression Lentivirus |
|||
LVP930 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h PITX3 Expression Lentivirus |
|||
LVP931 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h HDAC1 Expression Lentivirus |
|||
LVP1143 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h VEGFB Expression Lentivirus |
|||
LVP1146 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h PARP1 Expression Lentivirus |
|||
LVP1149 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h IL3RA Expression Lentivirus |
|||
LVP1150 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h PTCH1 Expression Lentivirus |
|||
LVP1155 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h SART3 Expression Lentivirus |
|||
LVP1159 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h TIGIT Expression Lentivirus |
|||
LVP1160 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h EDNRA Expression Lentivirus |
|||
LVP1165 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h Foxp3 Expression Lentivirus |
|||
LVP1172 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h APLP2 Expression Lentivirus |
|||
LVP1177 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h PCSK9 Expression Lentivirus |
|||
LVP1178 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h NTSR1 Expression Lentivirus |
|||
LVP1179 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h SKIV2L Expression Lentivirus |
|||
LVP919 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h SKIV2L Expression Lentivirus |
|||
LVP919-GP | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h TP5313 Expression Lentivirus |
|||
LVP926 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h ELOVL5 Expression Lentivirus |
|||
LVP929 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h MAGEA3 Expression Lentivirus |
|||
LVP1147 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h NANOS3 Expression Lentivirus |
|||
LVP1164 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h IL1RL1 Expression Lentivirus |
|||
LVP1168 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h CTAG1B Expression Lentivirus |
|||
LVP1169 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h MAGEA3 Expression Lentivirus |
|||
LVP1170 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h COX7A1 Expression Lentivirus |
|||
LVP1173 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h BCL11B Expression Lentivirus |
|||
LVP1180 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h CEACAM5 Expression Lentivirus |
|||
LVP1153 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h TNFSF11 Expression Lentivirus |
|||
LVP1157 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h TNFRSF1B Expression Lentivirus |
|||
LVP922 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h KIAA1324 Expression Lentivirus |
|||
LVP1175 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h KIAA0319L Expression Lentivirus |
|||
LVP920 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h KRAS (G12D) Expression Lentivirus |
|||
LVP1166 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h TP53 (R175H) Expression Lentivirus |
|||
LVP1167 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
h INS-IGF2 (GFP-Puro) Expression Lentivirus |
|||
LVP699-GP | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
r Syn1 Expression Lentivirus |
|||
LVP925 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
m RIKEN Expression Lentivirus |
|||
LVP1174 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
m CTAGA1 Expression Lentivirus |
|||
LVP916 | GenTarget | 1x107 IFU/ml x 200ul | 541.2 EUR |
Expression Negative Control Lentivirus (G418) |
|||
79902-G | BPS Bioscience | 500 µl x 2 | 795 EUR |
Expression Negative Control Lentivirus (Puromycin) |
|||
79902-P | BPS Bioscience | 500 µl x 2 | 795 EUR |
hsa-miR-375 (MI0000783) miRNA expression lentivirus |
|||
miR306 | GenTarget | (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes | 1034.4 EUR |
Expression Negative Control Lentivirus (Hygromycin) |
|||
79902-H | BPS Bioscience | 500 µl x 2 | 795 EUR |
hsa-miR-636 (MIMAT0003306) miRNA expression lentivirus |
|||
miR626 | GenTarget | (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes | 1034.4 EUR |
XPack CMV-XP-GFP-EF1-Puro Expression Lentivirus |
|||
XPAK530VA-1 | SBI | >1 x 10^6 IFUs | 759 EUR |
hsa-miR-4284 (MIMAT0016915) miRNA expression lentivirus |
|||
miR1164 | GenTarget | (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes | 1034.4 EUR |
XPack MSCV-XP-GFP-EF1-Puro Expression Lentivirus |
|||
XPAK730VA-1 | SBI | >1 x 10^6 IFUs | 759 EUR |
hsa-let-7f-5p (MIMAT0000067) miRNA expression lentivirus |
|||
miR11 | GenTarget | (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes | 1034.4 EUR |
hsa-miR-34a-5p (MIMAT0000255) miRNA expression lentivirus |
|||
miR112 | GenTarget | (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes | 1034.4 EUR |
hsa-miR-34a-3p (MIMAT0004557) miRNA expression lentivirus |
|||
miR113 | GenTarget | (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes | 1034.4 EUR |
has-miR-141-3p (MIMAT0000432) miRNA expression lentivirus |
|||
miR194 | GenTarget | (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes | 1034.4 EUR |
hsa-miR-155-5p (MIMAT0000646) miRNA expression lentivirus |
|||
miR246 | GenTarget | (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes | 1034.4 EUR |
hsa-miR-101-3p (MIMAT0000099) miRNA expression lentivirus |
|||
miR73 | GenTarget | (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes | 1034.4 EUR |
hsa-miR-876-3p (MIMAT0004925) miRNA expression lentivirus |
|||
miR732 | GenTarget | (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes | 1034.4 EUR |
hsa-miR-125b-5p (MIMAT0000423) miRNA expression lentivirus |
|||
miR178 | GenTarget | (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes | 1034.4 EUR |
hsa-miR-193a-3p (MIMAT0000495) miRNA expression lentivirus |
|||
miR238 | GenTarget | (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes | 1034.4 EUR |
mmu-mir-200c-3p (MIMAT0000657) miRNA expression lentivirus |
|||
miR3311 | GenTarget | (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes | 1034.4 EUR |
XPack CMV-XP-Luciferase-EF1-Puro Expression Lentivirus |
|||
XPAK532VA-1 | SBI | >1 x 10^6 IFUs | 759 EUR |
XPack MSCV-XP-Luciferase-EF1-Puro Expression Lentivirus |
|||
XPAK732VA-1 | SBI | >1 x 10^6 IFUs | 759 EUR |
ACE2 Expression Lentivector, pCDH-CMV-ACE2-EF1α-Puro (Pre-packaged Lentivirus) |
|||
CVD19-100VA-1 | SBI | >2x10^6 IFUs | 728 EUR |
NRP1 Expression Lentivector, pCDH-CMV-NRP1-EF1α-Neo (Pre-packaged Lentivirus) |
|||
CVD19-140VA-1 | SBI | >2x10^6 IFUs | 728 EUR |
CD95 CHO Cell Line (Medium or High Expression)-78499-H |
|||
78499-H | BPS Bioscience | 2 vials | 7150 EUR |
SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein (S) Expression Lentivector, pCDH-CMV-SARS-CoV-2-S-EF1α-Puro (Pre-packaged Lentivirus) |
|||
CVD19-130VA-1 | SBI | >2x10^6 IFUs | 728 EUR |
CD7 CHO Cell Line (Medium or High Expression)-78324-H |
|||
78324-H | BPS Bioscience | 2 vials | 7150 EUR |
SARS-CoV-2 Nucleocapsid (N protein) Expression Lentivector, pCDH-CMV-SARS-CoV-2-N-EF1α-Puro (Pre-packaged Lentivirus) |
|||
CVD19-120VA-1 | SBI | >2x10^6 IFUs | 728 EUR |
NCAM1 (CD56) CHO Cell Line (High, Medium, or Low Expression)-78352-H |
|||
78352-H | BPS Bioscience | 2 vials | 7150 EUR |
h OCT4 expression Adenovirus |
|||
AVP013 | GenTarget | 1x109 IFU/ml x 200ul | 418.8 EUR |
h SOX2 expression Adenovirus |
|||
AVP014 | GenTarget | 1x109 IFU/ml x 50ul | 418.8 EUR |
h LIN28 expression Adenovirus |
|||
AVP015 | GenTarget | 1x109 IFU/ml x 200ul | 418.8 EUR |
SARS-CoV-2 Humanized Spike Glycoprotein (S) Expression Lentivector, pCDH-CMV-SARS-CoV-2-hS-EF1α-Puro (Pre-packaged Lentivirus) |
|||
CVD19-135VA-1 | SBI | >2x10^6 IFUs | 728 EUR |
H-Ras Expression Vector Set |
|||
STA-457 | Cell Biolabs | 1 kit | 1765.2 EUR |
pSMPUW-Neo Lentiviral Expression Vector |
|||
VPK-213 | Cell Biolabs | 10 µg | 748.8 EUR |
pSMPUW-Puro Lentiviral Expression Vector |
|||
VPK-212 | Cell Biolabs | 10 µg | 748.8 EUR |
pSMPUW-Hygro Lentiviral Expression Vector |
|||
VPK-214 | Cell Biolabs | 10 µg | 748.8 EUR |
CD36 HEK293 Cell Line (High Expression) |
|||
78526-H | BPS Bioscience | 2 vials | 7150 EUR |
Active H-Ras Expression Vector Set |
|||
STA-459 | Cell Biolabs | 1 kit | 1765.2 EUR |
TLR9/CD289 |
|||
RA25070 | Neuromics | 100 ul | 568.8 EUR |
CD36 HEK293 Cell Line (Medium Expression) |
|||
78526-M | BPS Bioscience | 2 vials | 7150 EUR |
W niniejszym badaniu zastosowaliśmy gąbki miRNA, które poddano wymuszonej ekspresji przy użyciu wektora lentiwirusowego, aby obniżyć ekspresję miR-146a w ludzkich komórkach macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (hASC). hASC transdukowane gąbkami miR-146a wykazywały wzmocnione właściwości immunomodulujące, o czym świadczy zwiększona produkcja kluczowych czynników immunosupresyjnych. Czynniki te były w stanie zwiększyć ekspresję genów przeciwzapalnych i zahamować ekspresję genów zapalnych w makrofagach. Dalsze badania mechanistyczne wykazały, że supresja miR-146a aktywowała sygnalizację NF-κB w hASC, co sugeruje jego regulacyjną rolę w indukowanych przez gąbkę miR-146a zmianach immunomodulacyjnych w hASC.
Ponadto stwierdzono również, że supresja miR-146a stymuluje różnicowanie osteogenne hASC. Obserwowana regulacja w górę ekspresji SMAD4 wskazywała na udział SMAD4 w modulowaniu potencjału osteogennego hASC w odpowiedzi na supresję miR-146a. Nasze badanie przyczynia się do zrozumienia wpływu miR-146a na właściwości immunomodulujące i różnicowanie osteogenne hASC oraz podkreśla potencjalne zastosowanie zmodyfikowanych hASC gąbek miRNA-146a jako komórek nasiennych w inżynierii tkanki kostnej.