Warunkowa ekspresja genu za pośrednictwem lentiwirusa

Zdolność do zidentyfikowania roli konkretnego genu w systemie zależy od kontroli ekspresji tego genu. W tym protokole opisujemy metodę stabilnej, warunkowej ekspresji receptorów Nod-Like (NLR) w komórkach THP-1 przy użyciu lentiwirusowego systemu ekspresji. System ten łączy wszystkie niezbędne składniki do indukowanej tetracykliną ekspresji genów w pojedynczym lentiwektorze z konstytutywną koekspresją markera selekcyjnego, co jest skutecznym środkiem do kontrolowania ekspresji genów przy użyciu pojedynczej infekcji wirusowej komórek . Odbywa się to na lentiwirusowej platformie ekspresyjnej trzeciej generacji, która poprawia bezpieczeństwo lentiwirusów i pozwala na większą ekspresję genów niż wcześniejsze platformy lentiwirusowe.
Plazmid ekspresyjny lentiwirusa jest najpierw modyfikowany tak, aby zawierał gen będący przedmiotem zainteresowania kierowany przez promotor TRE (element odpowiedzi tetracyklinowej) w prostym etapie klonowania bramy, a następnie jest kotransfekowany do komórek HEK293T wraz z plazmidami pakującymi i otoczkowymi w celu wytworzenia wirusa. Wirus jest używany do infekowania interesującego typu komórki przy niskim MOI, tak że większość transdukowanych komórek zawiera pojedynczą integrację wirusa. Zakażone komórki hoduje się z selekcją, a integracja wirusa jest weryfikowana przez qPCR.
Ekspresja genów w stabilnie stransdukowanych komórkach jest indukowana doksycykliną i walidowana przez qPCR, immunoblot i cytometrię przepływową. Ta elastyczna lentiwirusowa platforma ekspresyjna może być wykorzystywana do stabilnej i silnej indukcji interesującego genu w szeregu komórek do wielu zastosowań. Streszczenie graficzne: Schematyczny przegląd transdukcji lentiwirusowej komórek THP-1.

Profil ekspresji genów   w komórkach jądrowych krwi obwodowej  lentiwirusa małych przeżuwaczy — seropozytywnych i seronegatywnych kóz mlecznych w ich pierwszej laktacji

Odpowiedź immunologiczna na antygen wirusowy powoduje naciek komórek zapalnych do tkanki, co stwarza odpowiednie środowisko do replikacji wirusa w makrofagach i rekrutacji większej liczby monocytów do miejsca infekcji lub utajonych monocytów. Celem pracy była analiza profilu transkryptomicznego komórek jądrowych krwi obwodowej izolowanych od kóz seropozytywnych i seropozytywnych wobec SRLV w szczytowym okresie ich pierwszej laktacji. Seropozytywne kozy SRLV zostały prawdopodobnie zakażone siarą. Zaprojektowano i opracowano  niestandardowe mikromacierze transkryptomiczne dla kóz , a mianowicie  macierz ekspresji genów Capra hircus , która zawiera około 50 000 unikalnych transkryptów na mikromacierz .
Tylko cztery geny ulegały zróżnicowanej ekspresji, z podwyższoną ekspresją genów GIMAP2, SSC5D i SETX oraz obniżoną ekspresją genu GPR37 u kóz seropozytywnych wobec SRLV seronegatywnych. Jednak w analizie RT-qPCR wynik dla genu SETX nie został potwierdzony. Różnice w ekspresji badanych genów wskazują na aktywny proces zapalny u kóz seropozytywnych SRLV we wczesnym stadium infekcji.
Expression Lentivirus
Expression Lentivirus

Konstrukcja swoistego Smo  lentiwirusa  i  ekspresja  zakażonych komórek raka trzustki pozytywnych dla przeciwciała powierzchniowego CD24CD44

Celem tego badania było skonstruowanie wektora lentiwirusa niosącego gen Smo i transfekowanie komórek raka trzustki, w których stwierdzono obecność przeciwciała powierzchniowego CD24CD44 oraz wykrycie zakaźności. Zaprojektowano i zsyntetyzowano lentiwirusa niosącego określony fragment Smo oraz przetestowano jego funkcjonalność. Do dalszych badań eksperymentalnych i porównań wykorzystano grupę nadekspresji, grupę hamującą i grupę kontrolną ujemną. Pomyślnie zaprojektowano i wyprodukowano wirusa. Najlepszym obciążeniem wirusowym był wirus 1X106 TU, w którym wzrost komórek i efekt fluorescencji w studzienkach hodowlanych z rozcieńczeniem polibrenem były najlepsze. Są to warunki transfekcji i parametry transfekcji dla kolejnych eksperymentów. Plazmid ten wykryto przeciwciałem flagowym metodą Western blot.W rezultacie miał duży specyficzny prążek 250kD, a białko błonowe było z powodzeniem nadeksprymowane.
  • Wyniki ekspresji Smo w pięciu grupach komórek po transfekcji wirusa wykryte za pomocą RT-PCR: grupa ślepa wyniosła 1,0038±0,0344, grupa ujemna CON238: 1,0276±0,2944d, grupa ujemna CON077: 0,8793±0,0402; Grupa nadekspresji LV-SMO15570-2: 2,7479±0,30808 i grupa inhibicji LV-SMO-RNAi37304-1: 0,2386±0,0481.
  • Istniały różnice między grupą z nadekspresją i grupą z inhibicją a pozostałymi trzema grupami. Jednorodność wariancji: Bartlett F = 4,3530, P = 0,0016 < 0,05, heterogeniczny . Test KW: cc2 = 10,9905* P = 0,0267 i wystąpiła różnica istotna statystycznie.
  • Zaprojektowany wirus osiągnął założone wymagania. Zaprojektowano fragment sRNA dla kluczowego genu Smo szlaku sygnałowego Hh i pomyślnie skonstruowano wektor lentiwirusa niosącego ten fragment.
  • Ekspresję Smo analizowano po transfekcji komórek SW1990CD24CD44-dodatnich, co sugeruje, że funkcja fragmentu RNA zaprojektowanego dla kluczowego genu Smo w tym eksperymencie była skuteczna.

Promowanie właściwości immunomodulujących i różnicowania osteogennego mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej in vitro przez  ekspresję gąbki miR-146a  za pośrednictwem lentiwirusa

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wywierają korzystny wpływ na naprawę tkanki kostnej zarówno poprzez funkcje immunomodulacyjne, jak i różnicowanie osteogenne. Jako jeden z pierwszych zidentyfikowanych miRNA, które regulują wrodzoną odpowiedź immunologiczną, doniesiono, że miR-146a służy jako regulator negatywnego sprzężenia zwrotnego w kilku przewlekłych chorobach zapalnych. Jednak większość badań koncentruje się na zrozumieniu, w jaki sposób miRNA-146a reguluje komórki odpornościowe i związane z nimi zaburzenia immunologiczne.

TLR9/CD289

RA25070 Neuromics 100 ul 474 EUR

h EGFR Expression Lentivirus

LVP1142 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h HDAC1 Expression Lentivirus

LVP1143 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h IL6 Expression Lentivirus

LVP1144 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h NRP1 Expression Lentivirus

LVP1145 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h VEGFB Expression Lentivirus

LVP1146 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h MAGEA3 Expression Lentivirus

LVP1147 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h MUC1 Expression Lentivirus

LVP1148 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h PARP1 Expression Lentivirus

LVP1149 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h IL3RA Expression Lentivirus

LVP1150 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h CD8a Expression Lentivirus

LVP1151 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h CD4 Expression Lentivirus

LVP1152 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h CEACAM5 Expression Lentivirus

LVP1153 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h PIGF Expression Lentivirus

LVP1154 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h PTCH1 Expression Lentivirus

LVP1155 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h BRAF Expression Lentivirus

LVP1156 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h TNFSF11 Expression Lentivirus

LVP1157 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h ROS1 Expression Lentivirus

LVP1158 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h SART3 Expression Lentivirus

LVP1159 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h TIGIT Expression Lentivirus

LVP1160 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h IL4 Expression Lentivirus

LVP1161 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h IL7 Expression Lentivirus

LVP1162 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h CD3E Expression Lentivirus

LVP1163 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h NANOS3 Expression Lentivirus

LVP1164 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h EDNRA Expression Lentivirus

LVP1165 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h IL1RL1 Expression Lentivirus

LVP1168 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h CTAG1B Expression Lentivirus

LVP1169 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h MAGEA3 Expression Lentivirus

LVP1170 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h KLK3 Expression Lentivirus

LVP1171 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h Foxp3 Expression Lentivirus

LVP1172 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h COX7A1 Expression Lentivirus

LVP1173 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h KIAA1324 Expression Lentivirus

LVP1175 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h KDR Expression Lentivirus

LVP1176 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h APLP2 Expression Lentivirus

LVP1177 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h PCSK9 Expression Lentivirus

LVP1178 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h NTSR1 Expression Lentivirus

LVP1179 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h BCL11B Expression Lentivirus

LVP1180 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h FAS Expression Lentivirus

LVP1181 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h NEK6 Expression Lentivirus

LVP1182 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h NEK7 Expression Lentivirus

LVP1183 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h CDR1 Expression Lentivirus

LVP917 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h CD47 Expression Lentivirus

LVP918 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h SKIV2L Expression Lentivirus

LVP919 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h SKIV2L Expression Lentivirus

LVP919-GP GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h KIAA0319L Expression Lentivirus

LVP920 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h GPNMB Expression Lentivirus

LVP921 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h TNFRSF1B Expression Lentivirus

LVP922 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h ADA Expression Lentivirus

LVP923 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h ESR1 Expression Lentivirus

LVP924 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h TP5313 Expression Lentivirus

LVP926 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h DECR1 Expression Lentivirus

LVP927 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h DECR2 Expression Lentivirus

LVP928 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h ELOVL5 Expression Lentivirus

LVP929 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h NMRK1 Expression Lentivirus

LVP930 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h PITX3 Expression Lentivirus

LVP931 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h NME4 Expression Lentivirus

LVP932 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

TranslationBlocker Human TLR9/ CD289 siRNA, 10nmol

QX28-10nmol EnQuireBio 10nmol 377 EUR

TranslationBlocker Human TLR9/ CD289 siRNA, 2nmol

QX28-2nmol EnQuireBio 2nmol 276 EUR

h KRAS (G12D) Expression Lentivirus

LVP1166 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h TP53 (R175H) Expression Lentivirus

LVP1167 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h INS-IGF2 (GFP-Puro) Expression Lentivirus

LVP699-GP GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

m RIKEN Expression Lentivirus

LVP1174 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

m CTAGA1 Expression Lentivirus

LVP916 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

r Syn1 Expression Lentivirus

LVP925 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

Human Toll Like Receptor 9 (TLR9) ELISA Kit

RD-TLR9-Hu-48Tests Reddot Biotech 48 Tests 478 EUR

Human Toll Like Receptor 9 (TLR9) ELISA Kit

RD-TLR9-Hu-96Tests Reddot Biotech 96 Tests 662 EUR

Human Toll Like Receptor 9 (TLR9) ELISA Kit

DLR-TLR9-Hu-48T DL Develop 48T 479 EUR

Human Toll Like Receptor 9 (TLR9) ELISA Kit

DLR-TLR9-Hu-96T DL Develop 96T 621 EUR

Human Toll Like Receptor 9 (TLR9) ELISA Kit

RDR-TLR9-Hu-48Tests Reddot Biotech 48 Tests 500 EUR

Human Toll Like Receptor 9 (TLR9) ELISA Kit

RDR-TLR9-Hu-96Tests Reddot Biotech 96 Tests 692 EUR

h TLR9 inducible lentiviral particles

LVP754 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h RBM10 inducible lentivirus

LVP1124 GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h OCT4 expression Adenovirus

AVP013 GenTarget 1x109 IFU/ml x 200ul 349 EUR

h SOX2 expression Adenovirus

AVP014 GenTarget 1x109 IFU/ml x 50ul 349 EUR

h LIN28 expression Adenovirus

AVP015 GenTarget 1x109 IFU/ml x 200ul 349 EUR

h CD19 (GFP-Pueo) Lentivirus

LVP1084-GP GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h RBM10 (GFP-Puro) Lentivirus

LVP1124-GP GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h KDR (GFP-Puro) Lentivirus

LVP1176-GP GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h ERBB2 (GFP-Puro) Lentivirus

LVP504-GP GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h DECR1 (GFP-Puro) Lentivirus

LVP927-GP GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h DECR2 (GFP-Puro) Lentivirus

LVP928-GP GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

h ELOVL5 (GFP-Puro) Lentivirus

LVP929-GP GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

hsa-miR-4284 (MIMAT0016915) miRNA expression lentivirus

miR1164 GenTarget (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes 862 EUR

hsa-miR-375 (MI0000783) miRNA expression lentivirus

miR306 GenTarget (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes 862 EUR

hsa-miR-636 (MIMAT0003306) miRNA expression lentivirus

miR626 GenTarget (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes 862 EUR

H-Ras Expression Vector Set

STA-457 Cell Biolabs 1 kit 1471 EUR

h NFE2L2 (NRF2) (GFP-Puro) lentivirus

LVP904-GP GenTarget 1x107 IFU/ml x 200ul 451 EUR

hsa-let-7f-5p (MIMAT0000067) miRNA expression lentivirus

miR11 GenTarget (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes 862 EUR

hsa-miR-34a-5p (MIMAT0000255) miRNA expression lentivirus

miR112 GenTarget (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes 862 EUR

hsa-miR-34a-3p (MIMAT0004557) miRNA expression lentivirus

miR113 GenTarget (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes 862 EUR

hsa-miR-125b-5p (MIMAT0000423) miRNA expression lentivirus

miR178 GenTarget (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes 862 EUR

has-miR-141-3p (MIMAT0000432) miRNA expression lentivirus

miR194 GenTarget (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes 862 EUR

hsa-miR-193a-3p (MIMAT0000495) miRNA expression lentivirus

miR238 GenTarget (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes 862 EUR

hsa-miR-155-5p (MIMAT0000646) miRNA expression lentivirus

miR246 GenTarget (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes 862 EUR

mmu-mir-200c-3p (MIMAT0000657) miRNA expression lentivirus

miR3311 GenTarget (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes 862 EUR

hsa-miR-101-3p (MIMAT0000099) miRNA expression lentivirus

miR73 GenTarget (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes 862 EUR

hsa-miR-876-3p (MIMAT0004925) miRNA expression lentivirus

miR732 GenTarget (1x107 IFU/ml x 200ul), x 2 tubes 862 EUR

XPack CMV-XP-GFP-EF1-Puro Expression Lentivirus

XPAK530VA-1 SBI >1 x 10^6 IFUs 826 EUR

XPack CMV-XP-Luciferase-EF1-Puro Expression Lentivirus

XPAK532VA-1 SBI >1 x 10^6 IFUs 826 EUR

XPack MSCV-XP-GFP-EF1-Puro Expression Lentivirus

XPAK730VA-1 SBI >1 x 10^6 IFUs 826 EUR
W niniejszym badaniu zastosowaliśmy gąbki miRNA, które poddano wymuszonej ekspresji przy użyciu wektora lentiwirusowego, aby obniżyć ekspresję miR-146a w ludzkich komórkach macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (hASC). hASC transdukowane gąbkami miR-146a wykazywały wzmocnione właściwości immunomodulujące, o czym świadczy zwiększona produkcja kluczowych czynników immunosupresyjnych. Czynniki te były w stanie zwiększyć ekspresję genów przeciwzapalnych i zahamować ekspresję genów zapalnych w makrofagach. Dalsze badania mechanistyczne wykazały, że supresja miR-146a aktywowała sygnalizację NF-κB w hASC, co sugeruje jego regulacyjną rolę w indukowanych przez gąbkę miR-146a zmianach immunomodulacyjnych w hASC.
Ponadto stwierdzono również, że supresja miR-146a stymuluje różnicowanie osteogenne hASC. Obserwowana regulacja w górę ekspresji SMAD4 wskazywała na udział SMAD4 w modulowaniu potencjału osteogennego hASC w odpowiedzi na supresję miR-146a. Nasze badanie przyczynia się do zrozumienia wpływu miR-146a na właściwości immunomodulujące i różnicowanie osteogenne hASC oraz podkreśla potencjalne zastosowanie zmodyfikowanych hASC gąbek miRNA-146a jako komórek nasiennych w inżynierii tkanki kostnej.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.